Pauline Knof wurde 1980 in Ost-Berlin geboren. Im Alter von fünf Jahren begann sie, Klavierspielen zu lernen, und nahm ab dem 13. Lebensjahr Ballett- und Gesangsunterricht.
Nach der Matura studierte sie an der Hochschule für Musik und Theater Rostock und war schon während ihres Studiums am dortigen Volkstheater in verschiedenen Rollen (u.a. im Musical "Swinging St. Pauli", Regie Johanna Schall) zu sehen.

Beim Schauspielschultreffen 2003 in Graz erhielt sie den Solopreis für ihre Darstellung der Esther im Stück "Victor oder die Kinder an die Macht". Von 2004 bis 2009 war sie festes Ensemblemitglied am Burgtheater Wien und spielte dort u.a. in "Der Sommernachtstraum" (Regie: Theu Boermans), "Minna von Barnhelm" (Regie: Andrea Breth), und als Anja in Tschechows "Kirschgarten" (Regie: Andrea Breth).

Ab 2009 war sie freischaffend tätig und arbeitete am Düsseldorfer Schauspielhaus ("Endstation Sehnsucht", "Bekannte Gesichter, Gemischte Gefühle"), Schauspielhaus Graz ("Verbrennungen"), Staatsschauspiel Stuttgart ("Der blaue Boll"), Landestheater Niederösterreich ("Einsame Menschen"), Schauspiel Köln ("Wastwater") und am Stadttheater Klagenfurt ("Geschichten aus dem Wienerwald").

2012 debütierte sie bei den Salzburger Festspielen als Natalie in "Prinz von Homburg" unter der Regie von Andrea Breth. Seit 2014 spielt sie die Cordelia in Peter Steins Inszenierung des "König Lear" am Burgtheater.

Fernsehbekannt wurde sie durch mehrere Folgen der Reihe "Polizeiruf 110" sowie anderen Fernsehfilmen und Episodenrollen in verschiedenen Serien.
In der Spielzeit 2012/13 war Pauline Knof als Lady Windermere in "Lady Windermeres Fächer" und in der Spielzeit 2015/16 in "Vor Sonnenuntergang" und in "Der Gockel" im Theater in der Josefstadt zu sehen. In der Spielzeit 2016/17 spielte Pauline Knof in "Der Schwierige", "Galápagos" und "Wie man Hasen jagt" im Theater in der Josefstadt und in "La Cage aux Folles" in den Kammerspielen der Josefstadt. In der Saison 2017/18 war sie in "Terror" in den Kammerspielen der Josefstadt sowie in "In der Löwengrube" im Theater in der Josefstadt zu sehen.
In der Spielzeit 2018/19 war sie in den Kammerspielen der Josefstadt zu sehen in "Acht Frauen" und in "Radetzkymarsch" und "Jacobowsky und der Oberst" im Theater in der Josefstadt. In der Saison 2019/20 spielte sie in "Die Strudlhofstiege" im Theater in der Josefstadt".

Agentur: Felix Bloch Erben